|
|
Využití různých typů povrchově modifikovaných magnetických nanočástic pro izolaci a purifikaci bakteriální DNA/RNA
Bednářová, Eliška
V předložené závěrečné práci „Využití různých typů povrchově modifikovaných magnetických nanočástic pro izolaci a purifikaci bakteriální DNA/RNA“ byly využity magnetické částice, které byly povrchově modifikovány tetraethoxysilanem (TEOS) a (3-aminopropyl)triethoxysilanem (APTES). Cílem bylo optimalizovat protokol izolace nukleových kyselin pomocí magnetických částic z gram negativních i gram pozitivních bakterií, aby se dosáhlo co nejvyšší výtěžnosti RNA. V teoretické části práce byla shrnuta struktura a složení bakteriálních buněk, především složení buněčné stěny, díky které se bakterie rozdělují na gram pozitivní a gram negativní. Dále byly uvedeny jednotlivé možnosti detekce bakterií, které se využívají v klinické praxi. Při detekci bakterií pomocí molekulárních metod je často zásadním krokem izolace nukleových kyselin. Jednou z metod izolace je izolace pomocí magnetických částic, u které byl vysvětlen princip. U magnetických částic bylo popsáno složení a využívané funkcionalizace částic pro izolace nukleových kyselin. V praktické části práce byly magnetické částice nejprve charakterizovány několika metodami z důvodu specifikace jejich vlastností. Mohly tak být vybrány nejvhodnější částice pro izolace nukleových kyselin. Dále byly částice použity na optimalizace protokolu izolace nukleových kyselin z buněčného lyzátu, kdy se nejvíce osvědčil lyzační pufr s 30% detergentem Triton X-100, který měl podobné výsledky jako 30% detergent EcoSurf. Následovně byla hledána metoda efektivní lýzy bakteriálních buněk. Bylo využito několik metod, nejlepších výsledků dosáhla mechanická homogenizace zirkonovými kuličkami o velikosti 0,1 mm v kombinaci s lyzačním pufrem s 1% detergentem EcoSurf. Výtěžnost RNA z izolací pomocí magnetických částic byla porovnána s izolací pomocí kolonkové metody, přičemž byl na izolace použit komerční izolační kit. Pomocí kolonkové metody bylo dosaženo výtěžnosti RNA u S. aureus přibližně 350 ng/µl, při použití magnetických částic tomu bylo o 70 ng/µl méně. Výtěžnost RNA za pomoci komerčních pufrů byla značně vyšší než při použití vlastních pufrů, proto by bylo vhodné dále optimalizovat protokol izolace a složení vlastních pufrů při izolaci nukleových kyselin. Magnetické částice s modifikací TEOS i APTES mají velký potenciál pro využití při izolacích nukleových kyselin z bakterií.
|
|
|
Laboratorní diagnostiky mikrometastáz u pacientek s karcinomem prsu
Mikulová, Veronika ; Zima, Tomáš (vedoucí práce) ; Svoboda, Marek (oponent) ; Průša, Richard (oponent)
Úvod: Přítomnost cirkulujících nádorových buněk (CTC) v periferní krvi je asociována s horší prognózou a časným relapsem u pacientek s karcinomem prsu. Stanovení přítomnosti CTC v periferní krvi je nyní považováno za tzv. tekutou biopsii. Cílem této práce bylo stanovení přítomnosti CTC a jejich molekulární charakterizace s potenciálním využitím nejen jako nový biomarker pro sledování účinnosti systémové terapie ale také jako vhodný nástroj pro stratifikaci pacientek a následnou individualizaci léčby karcinomu prsu. Metody: Do prospektivní studie bylo zařazeno 54 pacientek s časným karcinomem prsu. Opakovaně jsme odebírali 10ml periferní krve pro stanovení přítomnosti a charakterizaci CTC v průběhu léčby. Izolace a detekce CTC byla provedena za použití AdnaTest BreastCancer™ kitu (AdnaGen AG, Německo) využívající kombinaci imunomagnetické separace s multiplex PCR pro stanovení transkriptů epiteliálních a tumor-asociovaných genů (EpCAM, MUC1 a HER2) v lyzátu CTC. Následně byla cDNA z izolovaných CTC použita pro analýzu genových expresí TOP1, TOP2A, CSTD, ST6GAL, KRT19 a aktin pomocí nově navržených a optimalizovaných esejí pomocí kvantitativní PCR (qPCR). Výsledky qPCR byly analyzovány pomocí softwaru Genex (MultiD Analysis). Výsledky: Celkem jsme vyšetřily 195 vzorků periferní krve. Přítomnost CTC...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.